自新式冠状病毒引起的疫情爆发以来，科学家们一直在尽力寻觅有用的病毒按捺剂。当地时刻3月20日，尖端学术期刊《科学》在线宣布了一篇题为“Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved α-ketoamide inhibitors”的研讨报告，科学家们用X射线以1.75埃分辨率解析了新冠病毒Mpro的晶体结构。新冠病毒中的首要蛋白酶（Mpro，又称为3CLpro）是一个重要的潜在药物靶标，对按捺病毒的仿制至关重要。
此外，该研讨探讨了一种α-酮酰胺按捺剂的效果。经过优化结构，研讨人员将先导化合物开发成为SARS-CoV-2 Mpro的有用按捺剂。优化按捺剂的药代动力学特征显现出显着的肺向性，而且适用于经过吸入途径给药。
因为尚无具有类似裂解特异性的人蛋白酶，该按捺剂不太或许具有毒性。在新冠病毒仍在全球暴虐的当下，该研讨有利于推进相关按捺剂的规划，促进医治办法的构成。
该文章的作者首要由德国科研团队组成，包含德国吕贝克大学、德国汉诺威医学院、柏林大学隶属夏里特医院、马尔堡大学、赫尔姆霍兹感染研讨中心、我国长春吉大天元化学技能股份有限公司等，通讯作者为德国吕贝克大学生物化学研讨所Rolf Hilgenfeld。
结构生物学家Rolf Hilgenfeld团队自2002-2003年严峻急性呼吸系统综合征（SARS）爆发以来，就一直在测验开发医治冠状病毒的办法。当时，Hilgenfeld期望对新式冠状病毒感染的动物进行两种按捺剂化合物的测验，以期赶快开宣布针对未来冠状病毒爆发的医治办法。
新冠病毒是一种单链RNA正链包膜乙型冠状病毒。与引起SARS（严峻急性呼吸系统综合症）和MERS（中东呼吸系统综合症）的另两种冠状病毒类似，它的基因组编码为非结构蛋白、结构蛋白和辅助蛋白。
非结构蛋白包含3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶（3-chymotrypsin-like protease，3CLpro）、木瓜蛋白酶样蛋白酶（papain-like protease）、解旋酶（helicase）、和RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）。结构蛋白则包含刺突糖蛋白（spike glycoprotein）。
冠状病毒中最具特征的药物靶标之一是上述的3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶，即首要蛋白酶（Mpro，也称为3CLpro）。与木瓜蛋白酶相同，这种酶在大型多蛋白1ab上的不少于11个切开位点上运转，关于加工从病毒RNA翻译的多蛋白是必不可少的，因而，按捺这种酶的活性将阻挠病毒仿制。
此前，研讨人员现已规划并合成了拟肽α-酮酰胺，作为β冠状病毒和α冠状病毒的首要蛋白酶以及肠病毒的3CLpro的广谱按捺剂。
几种α-酮酰胺按捺剂的化学结构，11r为绿色圆圈，13a为赤色圆圈，13b为蓝色圆圈
上述按捺剂化合物对MERS-CoV中东呼吸系统综合征冠状病毒、SARS-CoV（严峻急性呼吸系统综合征冠状病毒）和肠道病毒均具有抗病毒效果，但其活性好像在很大程度上取决于试验中运用的细胞类型。
为了优化它以延伸化合物在血浆中的半衰期，研讨人员将P3-P2酰胺键隐藏在吡啶酮环中，润饰了现有的化合物11r（上图中绿色圆圈），以期这可以阻挠细胞蛋白酶挨近该键并使其裂解。
此外，为添加化合物在血浆中的溶解度并削减其与血浆蛋白的结合阻力，研讨人员用疏水性稍差的Boc基团替代了疏水的肉桂酰基部分，得到13a这种化合物（上图中的赤色圆圈）。
为了查看13a中引进的吡啶酮环是否与靶标的三维结构兼容，研讨人员确认了SARS-CoV-2首要蛋白酶的晶体结构（分辨率为1.75 ）。
两种不同视图下SARS-CoV-2 首要蛋白酶的三维结构
研讨人员发现，新冠病毒首要蛋白酶的三维结构与SARS-CoV首要蛋白酶的三维结构高度类似，序列同一性达96％。
其间，胰凝乳蛋白酶和小核糖核酸病毒3C蛋白酶样结构域I和II构成六链反平行β桶，在它们之间带有底物结合位点。结构域III是五个螺旋的球形簇，首要经过2个前体间盐桥相互效果参加调理Mpro的二聚化。
SARS-CoV-2的Mpro构成的严密二聚体具有一个触摸界面，首要坐落分子A的结构域II与分子B的NH2结尾残之间。
研讨人员运用蛋白酶的晶体结构来对接α-酮酰胺按捺剂13a。他们发现，与11r比较，13a在小鼠中的血浆半衰期添加了约3倍（从0.3小时到1.0小时），体外动力学血浆溶解度提高了约19倍，一起热动力学溶解度提高了约13倍。可是，与11r比较，结构的调整导致其对SARS-CoV-2首要蛋白酶和肠病毒3C蛋白酶的按捺活性有所削减。
事实上，包含新冠病毒在内的β冠状病毒Mpro的S2口袋具有明显的可塑性，使其可以“奸刁”地习惯较小按捺剂的形状。因而为了增强针对进化枝b的β冠状病毒的抗病毒活性，研讨人员献身了按捺剂广谱活性的方针，用较小的环丙基替代了13a的P2环己基部分，得到化合物13b（本文图1中的蓝色圆圈）。
α-酮酰胺13b与SARS-CoV-2的Mpro的复合物X射线晶体结构，两种分辨率分别为1.95 和2.20
研讨人员运用20 mg / kg的剂量对小鼠进行皮下途径的药代动力学研讨发现，化合物13a在小鼠血浆中的均匀停留时刻为约1.6小时，停留时刻最多为约4小时，经过尿液排出的时刻最多为24小时。血管外给药后药物在血浆中的最高浓度值（峰浓度，Cmax）为334.5ng/mL。
虽然13a从血浆中消失的速度非常快，但24小时后它在肺中的浓度为135ng/g，在小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中的浓度为52.7ng/mL，这表明它现已被安排吸收。
接下来，研讨人员对13b的有用性进行了测验，他们发现，13b与人血浆蛋白的结合度到达90％。
相同对小鼠进行皮下注射时，研讨人员用了更少的剂量（3 mg/kg），发现13b的Cmax为126.2 ng / mL，这大约是13a的峰浓度值的37％，但所用的化合物剂量大约降低了7倍。
一起，13b在血浆中的均匀停留时刻延伸至2.7小时，半衰期约为1.8小时。与13a比较，13b在血浆中的铲除速度较慢。
研讨人员发现，4小时后，13b在小鼠肺安排中浓度仍到达约13ng/g。因为新冠病毒疾病对肺部有较大影响，13a和13b体现出的这种肺向性是有利的。
除皮下给药外，研讨人员还运用吸入设备以3mg/kg对小鼠进行了雾化13b给药。 24小时后，小鼠肺安排中存在13b的浓度为33ng/g。
小鼠关于按捺剂的吸入耐受杰出，未显现任何不良反应，研讨者们以为这表明将该化合物直接施用于肺部是或许的。
作者们最终写道，鉴于这些有利的药代动力学成果，此次研讨为含吡啶酮的抗冠状病毒药物研制供给了有用的结构。
